病理組織包埋染色俗稱HE 染色法為蘇木精-伊紅染色法，是石蠟切片技術里常用的染色法之一，也是組織學、胚胎學、病理學教學與科研中基礎、廣泛的技術方法。

　　屬性為堿性的蘇木素染色液可以使細胞著藍色，為酸性的伊紅使細胞著紅色，其結果胞核呈藍色，胞漿呈紅色。兩種不同的染色液使細胞通過顏色來改變折光率，在光鏡下呈現出細胞圖像。

　　病理組織包埋染色之所以成為細胞染色常用的方法是因為HE染色法過程中除化學反應外，還有物理作用中吸附、吸收效果，使HE染色提供良好的核漿對比染色效果。

 

 病理組織包埋染色實驗步驟

　　若細胞用4％多聚甲醛固定，則染色時間相應延長，蘇木素染色12-15min，伊紅5min即可。

　　6、培養瓶、培養皿、鑷子、蓋玻片、載玻片、顯微鏡。
 

　　病理組織包埋染色常見規格為310ml和3100lm。

    　2、蘇木精溶液染色：

　　(5)蒸餾水過洗 5 s 

　　(2) 蒸餾水稍洗 30 s

　　(8)中性樹膠封固
 

　　著色深淺與組織或細胞的種類有關，也隨其生活周期及病理變化而改變。例如，細胞在新生時期胞漿對伊紅著色較淡或輕度嗜堿，當其衰老時或發生退行性變則呈現嗜伊紅濃染。膠原纖維在老化和出現透明變性時，伊紅著色由淺變深。

病理組織包埋染色全組織包埋免疫熒光染色

　　另取5只小鼠經水合氯醛麻醉后，建立跨區耳瓣模型，方法同前。在建模后第3天處死小鼠，脫毛液盡量去除小鼠耳部毛發，將耳瓣側耳部剪下，利用生理鹽水洗凈，在光學放大體式顯微鏡下使用剪刀和鑷子進一步去除毛發。接著按照以下步驟進行組織處理：（1）將剪下的小鼠耳放入裝有甲醇的EP管中，沉至管底，-20 ℃保存至少30 min；（2）取出鼠耳，放入裝有Hanks平衡鹽液的培養皿中，在體式顯微鏡下利用鑷子緩慢分離，將耳組織分為前層皮膚、軟骨及后層皮膚，將分離出的前層皮膚放入裝有4%的多聚甲醛的EP管中，4 ℃固定1 h直至組織沉淀至管底；（3）取出前層皮膚，放入1×PBS中洗滌3次，每次5 min；（4）取出洗滌后的前層皮膚，置于裝有1×PBS緩沖液的培養皿中，在光學放大體式顯微鏡下使用剪刀和鑷子剔除多余的脂肪結締組織，進行精修。

　　對建立跨區耳瓣模型第3 d的鼠耳進行全組織包埋免疫熒光染色，觀察跨區耳瓣模型建立3 d后，跨區耳瓣choke區域小血管及毛細血管的管徑大小，末梢神經走行以及與血管再生相關的單核巨噬細胞［4］分布情況。CD31與α-SMA抗體分別對血管內皮與血管平滑肌進行染色，利用Tuj1及α-SMA對軸突與血管分別進行標志，利用CD68抗體進行單核巨噬細胞染色。具體操作步驟如下：（1）制備封閉液（簡稱10%HIGS），將10 ml山羊血清、0.2 ml曲拉通X-100溶于100 ml磷酸鹽緩沖液中,并應用0.45 μm的濾器對配成的溶液進行濾過。（2）在室溫條件下，將處理完的鼠耳前層皮膚放入裝有1 ml 10% HISG的24孔板中，搖床輔助孵育30 min。（3）制備一抗溶液，使用10%HIGS稀釋一抗，稀釋比例1∶500。將CD31、CD68、α-SMA、Tuj1一抗同時稀釋混合使用，孵育時間較長時可加入0.2%抑菌防腐。（4）將經孵育的皮膚取出放入新孔或用滴管吸除10%HIGS溶液后，加入150 μm一抗溶液，4 ℃搖床孵育過夜，第2天將皮膚轉移至新孔洞或用滴管吸除原有溶液，加入1 ml 2%HIGS溶液，室溫下搖床洗脫一抗3次，每次15 min，每次洗脫更換液體。（5）制備二抗溶液，使用10%HIGS稀釋二抗，稀釋比例1∶500，將CD31、CD68、α-SMA、Tuj1二抗同時稀釋混合使用，通過0.22 μm的生物濾膜對配成的液體進行過濾。13 000 g離心二抗溶液，離心5 min。（6）將洗脫后的皮膚取出，放入新孔洞或用滴管吸除原有溶液，加入150 μm二抗溶液，室溫下搖床孵育1 h，避光。（7）取出皮膚，將皮膚轉移至新孔洞，加入1 ml 2%HIGS溶液。室溫下，搖床洗脫二抗3次，每次15 min，每次洗脫更換液體。（8）取出皮膚，轉移至新孔洞，加入150 μm DAPI (1∶1000) 溶液染色，孵育10 min。（9）取出皮膚，轉移至新孔洞，加入1 ml 2%HIGS溶液。室溫下，搖床洗脫3次，每次15 min，每次洗脫更換液體。（10）把組織樣本放入載玻片上鋪平，滴加1滴熒光封片劑，封蓋蓋玻片,放于室溫過夜，待熒光封片劑凝固，于共聚焦激光顯微鏡下掃描觀察。
 

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